Біологія. 9 клас. Шаламов

§ 61. Генна та клітинна інженерія

Молекулярні основи спадковості — ключ до сучасних біотехнологій

У результаті роботи ферменту утворюються два фрагменти з липкими кінцями — комплементарними один одному одноланцюговими послідовностями нуклеотидів.

У другій половині ХХ століття з розвитком генетики та молекулярної біології людина отримала змогу не тільки добирати наявні в природі комбінації генів, а й безпосередньо втручатися в спадковість організмів, створюючи живих істот із цілком новими властивостями.

Рис. 61.1. Розрізання молекули ДНК рестриктазою

Це стало можливим завдяки низці ключових відкриттів у галузі молекулярної генетики та з’ясуванню механізмів передачі й реалізації спадкової інформації. Згадаємо основні етапи цього шляху.

1928 року англійський лікар Фредерік Гриффіт відкрив явище бактерійної трансформації, тобто здатності бактерій поглинати з довкілля якийсь «трансформувальний фактор», який змінює спадковість.

1944 року американський біохімік Освальд Евері дослідив хімічну природу цього фактора: ним виявилася, як нам тепер добре відомо, ДНК. Уперше в історії науки ця молекула була пов’язана зі спадковістю!

Наприкінці 1960-х років було відкрито ендонуклеази рестрикції, або скорочено рестриктази, що дають змогу розрізати молекули ДНК у місцях розташування певних послідовностей (рис. 61.1).

Приблизно водночас із відкриттям рестриктаз, 1967 року був відкритий ще один ключовий фермент — ДНК-лігаза. Лігаза зшиває окремі молекули ДНК між собою, й поряд із рестриктазами її широко використовують у молекулярній біології та біотехнології.

1970 року Говард Темін і Девід Балтімор відкрили зворотну транскриптазу — вірусний фермент, здатний синтезувати ДНК на матриці РНК (раніше вважалося, що це неможливо). Відкриття Теміна й Балтімора уможливило роботу не лише з геномною ДНК організмів, а й безпосередньо з їхньою РНК.

1972 рік можна вважати роком народження генної інженерії: у цьому році Пол Берг у Стенфорді отримав першу рекомбінантну молекулу ДНК, тобто молекулу, утворену шляхом убудовування одного фрагмента ДНК в інший (рис. 61.2). У 1980 році Пол Берг за цю роботу отримав Нобелівську премію з хімії.

1978 року технологію рекомбінантних ДНК було вперше застосовано на практиці: ген людського інсуліну було перенесено до кишкової палички, а вже 1982 року компанія Genentech випустила перший комерційний препарат рекомбінантного білка інсуліну¹.

¹ Нагадаємо, інсулін — це гормон поліпептидної природи. Він виробляється підшлунковою залозою та регулює обмін речовин і, насамперед, концентрацію глюкози в крові.

Брак інсуліну призводить до тяжкого захворювання — цукрового діабету, який вважали невиліковним до 1922 року, коли було винайдено спосіб очищення інсуліну з бичачих підшлункових залоз. До 1982 року виділення інсуліну з тканин тварин було єдиним способом його отримання для лікування хворих на діабет. Сьогодні більшість інсуліну, що є на ринку, виробляють за допомогою генної інженерії.

1987 року Кері Мулліс розробив метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) — простий спосіб швидкого отримання великої кількості копій певної ділянки ДНК, про який ви вже знаєте з § 39. Кері Мулліс 1993 року отримав Нобелівську премію з хімії за створення ПЛР.

Розвиток технологій рекомбінантних ДНК на цьому не зупинився. Наразі генна інженерія (її ще називають генетичною інженерією), тобто сукупність методів здійснення маніпуляцій із генами, стала найважливішим інструментом біотехнології. Із використанням методів генної інженерії виробляють рекомбінантні гормони, вакцини, інтерферон, антибіотики та інші продукти. Було розроблено методи переносу генів до клітин не лише бактерій, а й багатоклітинних організмів — рослин і тварин. Із питаннями отримання генетично модифікованих багатоклітинних організмів ми ознайомимося в § 63, а зараз розглянемо методи, що їх використовують у роботі з бактеріями.

Генна інженерія дає змогу вбудовувати гени одних організмів в інші

Розглянемо типову послідовність дій на простому прикладі створення бактерії, що синтезує якийсь білок людини (саме такий підхід використовують для виробництва рекомбінантного інсуліну). Протягом 1970-1980-тих років ця технологія зробила справжню революцію; а нині процес настільки відпрацьований, що кваліфікований біолог у добре обладнаній лабораторії може створити таку бактерію менш ніж за тиждень роботи. Стандартна послідовність дій із перенесення гена до бактеріальної клітини має кілька етапів (рис. 61.3).

Першим етапом є отримання ізольованого цільового гена. Ви вже знаєте, що ген — це ділянка молекули ДНК, відповідальна, найчастіше, за синтез одного білка. Джерелом гена для роботи зазвичай слугує або ДНК організму, або його РНК. Використовувати РНК краще, бо вона не містить інтронів — некодувальних послідовностей. Але робота з РНК включає додатковий етап: на її основі спочатку за допомогою ферменту зворотної транскриптази синтезують так звану комплементарну ДНК (кДНК). Крім природних джерел, ДНК можна отримати штучно, за допомогою хімічного синтезу. Із розвитком методів хімічного синтезу послідовностей ДНК нині цей спосіб стає все популярнішим.

Рис. 61.2. Схема створення рекомбінантної ДНК

Рис. 61.3. Схема генної інженерії

Завдяки рестиктазі вирізається потрібний фрагмент із чужорідної ДНК, а також розрізається плазміда. Отримані ДНК зшиваються лігазою для отримання вектора для трансформації. Після трансформації не всі бактерії отримують плазміду з геном. І на поживному середовищі з антибіотиком виростають лише ті, що отримали плазміду з геном стійкості до антибіотика.

1. Чужорідна ДНК. 2. Плазміда. 3. Ген стійкості до антибіотика. 4. Обробка рестриктазою. 5. Цільовий ген. 6. Вбудовування гена до плазміди. 7. Трансформація. 8. Вирощування трансформованих клітин.

При використанні ДНК чи РНК із природних джерел виникає проблема: у кожній клітині є десятки тисяч генів. Аби перенести до бактерії лише один із них, треба спочатку отримати його в зручній для роботи формі. Для цього використовують порівняно простий і надійний спосіб — полімеразну ланцюгову реакцію, яка дає змогу «розмножити» потрібну ділянку ДНК, щоб отримати багато її копій. Одержаний фрагмент містить всю інформацію про амінокислотну послідовність білка, що нас цікавить, але напряму перенести його до бактерії не можна — він буде в ній непрацездатним, бо не містить жодних «інструкцій» щодо роботи з ним.

Аби він запрацював у бактерії, потрібен наступний етап роботи — вбудовування гена в бактеріальний вектор. Вектором називають спеціальну молекулу ДНК, призначену для перенесення генетичного матеріалу. Хоча в бактерій немає справжнього статевого розмноження, але є спеціальні механізми обміну невеличкою частиною спадкової інформації, закодованої в плазмідах — кільцевих молекулах ДНК довжиною в кілька тисяч пар нуклеотидів. Плазміди, що трапляються в природі, зазвичай містять кілька корисних генів, наприклад таких, що забезпечують стійкість бактерій до антибіотиків. Вектори для перенесення генетичного матеріалу зазвичай створюються саме на основі таких плазмід.

Щоб вбудувати людський ген у бактеріальний вектор, у векторі спочатку роблять розріз за допомогою спеціальних ферментів — рестриктаз, після чого змішують із ДНК, що кодує людський білок (саме вона була отримана на попередньому етапі), і зшивають розріз за допомогою ферменту ДНК-лігази.

Третій етап — перенесення вектора до бактерії. Цей процес ґрунтується на природній властивості бактерій поглинати невеличкі молекули ДНК та має назву бактеріальна трансформація. Найчастіше використовують клітини звичайної кишкової палички, але для різних цілей можуть застосовувати бактерії чи дріжджі інших видів.

Далі здійснюють добір трансформованих клітин. Вектори зазвичай містять не лише регуляторні послідовності ДНК, що змушують бактерію здійснювати транскрипцію вбудованих у вектор генів, а й гени-маркери (наприклад, гени стійкості до антибіотиків), що дають змогу швидко відбирати клітини, у які вектор вбудувався.

Кожна така клітина дасть початок великій кількості клітин, кожна з яких також міститиме вектор. Генетично ідентичне потомство однієї клітини називають клоном, а весь процес отримання великої кількості ідентичних молекул ДНК — молекулярним клонуванням.

Отримана в результаті бактерія вироблятиме людський білок, який за допомогою нескладних фізико-хімічних методів можна легко очистити від домішок і використати. Завершальним (і при цьому найбільш трудомістким і найдорожчим) етапом створення будь-якого комерційного генетично модифікованого продукту є перевірка його безпечності для здоров’я людини й навколишнього середовища. Якщо кваліфікований біолог за вдалих обставин може створити трансгенний мікроорганізм лише за кілька днів, то випробування властивостей цього мікроорганізму й перевірка безпечності в деяких випадках тривають роки.

Рис. 61.4. Отримання гібридом, що синтезують антитіла

1. Антиген. 2. Організм-донор лімфоцитів. 3. Лімфоцит. 4. Антитіло. 5. Клітина пухлини. 6. Гібридома. 7. Утворені антитіла.

Завдяки клітинній інженерії можна створювати нові типи клітин

Приблизно водночас із генною інженерією почав розвиватися новий прикладний напрям біотехнології — клітинна інженерія. Клітинна інженерія — це сукупність методів отримання нових типів клітин, їх вирощування та практичного застосування. Методи вирощування клітин тварин поза організмом було розроблено ще на початку ХХ століття, але започаткували розвиток клітинної інженерії дослідження, проведені в 1960-х роках. Тоді було розроблено методи соматичної гібридизації — штучного злиття соматичних клітин з отриманням життєздатних клітин, здатних практично безкінечно утворювати подібних собі. Методи соматичної гібридизації дають змогу отримувати гібридні клітини з клітин різних типів або навіть із клітин організмів різних біологічних видів. Такі клітини не лише цікаві для фундаментальних біологічних досліджень (наприклад, за їхньою допомогою було визначено місце розташування різних генів на хромосомах людини), а й мають важливе практичне значення. Наприклад, гібридні клітини, утворені шляхом злиття лімфоцитів із пухлинними клітинами, здатні виробляти антитіла, як це роблять лімфоцити, і при цьому необмежено довго ділитися під час вирощування (рис. 61.4). Такі клітини мають назву гібридоми. Вони слугують основним джерелом промислового виробництва антитіл.

Поміркуймо

Знайдіть одну правильну відповідь

1. Інсулін належить до такого класу сполук, як

• А білки
• Б ліпіди
• В вуглеводи
• Г нуклеїнові кислоти
• Д неорганічні сполуки

2. За допомогою рестриктаз і лігаз можна

• А розрізати та зшивати молекули ДНК
• Б копіювати специфічні послідовності ДНК
• В переносити гени з одного організму до іншого
• Г здійснювати селекцію трансгенних організмів
• Д пригнічувати дію мутагенів

3. Найчастіше для експериментів у галузі генної інженерії використовують такий вид мікроорганізмів, як

• А кишкова паличка
• Б туберкульозна паличка
• В амеба
• Г дріжджі
• Д стафілокок

4. За молекулою РНК синтезують комплементарну їй ДНК за допомогою такого ферменту, як

• А ДНК-полімераза
• Б лігаза
• В рестриктаза
• Г зворотна транскриптаза
• Д РНК-полімераза

5. Процес поглинання бактеріальною клітиною молекули ДНК із навколишнього середовища має назву

• А трансформація
• Б трансляція
• В транскрипція
• Г транслокація
• Д трансмутація

Сформулюйте відповідь кількома реченнями

6. Опишіть послідовність дій для клонування гена зеленого флуоресцентного білка з медузи еквореї в кишковій паличці.

7. Які наукові відкриття потрібно було здійснити, щоб генна інженерія стала реальністю?

8. Як створення технології генної інженерії бактерій допомогло медицині?

9. Як у схемі, що представлена на рисунку 61.3, здійснюється добір колоній, що містять цільовий ген?

10. Поясніть методику отримання гібридом. Як використовують гібридоми?

Знайди відповідь і наблизься до розуміння природи

11. У чому переваги методів генної інженерії порівняно з методами класичної селекції мікроорганізмів? Чому, незважаючи на це, селекцію мікроорганізмів продовжують застосовувати й зараз?

12. Гібриди яких організмів вдалось отримати методами соматичної гібридизації? Чи знадобилися ці організми науці та виробництву?

13. Як за допомогою соматичної гібридизації вдалося дізнатися, на яких хромосомах людини розташований той чи той ген?

Дізнайся самостійно та розкажи іншим

14. Схарактеризуй потенційні біологічні загрози, пов’язані зі створенням і використанням генетично модифікованих бактерій.

15. Розкажи про перспективи застосування генетично модифікованих мікроорганізмів у різних сферах людської діяльності.